Introduction

1Les propriétés thérapeutiques des champignons sont utilisées depuis des millénaires par les populations de plusieurs régions du monde pour soigner de nombreuses pathologies humaines. En effet, selon de nombreux auteurs (Alves et al., 2012 ; Cao et al., 2012 ; Giavasis, 2014 ; Hobbs, 1995 ; Quang et al., 2006 ; Smith et al., 2002 ; Thawthong et al., 2014), les peuples d’Orient reconnaissaient, il y a des milliers d’années, les effets bénéfiques de nombreuses espèces comestibles et non comestibles de champignons sur la santé humaine. Plusieurs études scientifiques ont récemment montré que de nombreuses espèces de champignons contiennent des molécules dont les propriétés médicinales sont avérées. Ces champignons sont, entre autres, cardioprotecteurs, hépatoprotecteurs, antitumoraux, antidiabétiques, anti-inflammatoires, anti-infectieux, anti-VIH, antibactériens et/ou antifongiques et, pour certains, immunomodulateurs. Ces auteurs citent également de nombreuses espèces cumulant plusieurs de ces propriétés médicinales. Ces informations peuvent être consultées en ligne sur des sites internet spécialisés : www.fungi.com/mycomed.html ; www.fungi.com ; www.gmushrooms.com/healthref.html.

2De nos jours, malgré l’efficacité avérée des antibiotiques et des produits antifongiques de synthèse sur la plupart des infections microbiennes, on observe l’apparition de résistances microbiennes d’ampleur variable suivant les types d’infection. Plusieurs des auteurs cités supra, mais aussi beaucoup d’autres, ont investigué d’autres sources potentielles de nouvelles molécules plus efficaces, physiologiquement bénéfiques et non toxiques pour l’organisme humain (Elsayed et al., 2014 ; Josh et Janardhanan, 2000 ; Muszynska et al., 2018 ; Nowakowski et al., 2021 ; Ragasa, 2018 ; Sen et al., 2021 ; Wasser, 2017).

3Environ 140 000 macromycètes (champignons macroscopiques) sont connus à ce jour, dont 10 % seulement (≈ 14 000 espèces) ont été décrits. Plus de 2 300 espèces sont comestibles ou à potentiel médicinal (Çaglarirmak, 2011 ; Maas et al., 2012 ; Ying et al., 1987), mais très peu d’entre elles ont été étudiées à ce jour pour leur potentiel pharmacologique. En effet, les travaux de recherche en phytochimie ont été, jusqu’à présent, orientés essentiellement sur les plantes chlorophylliennes.

4Les macromycètes tropicaux d’Afrique sont très diversifiés mais particulièrement peu étudiés, hormis quelques rares travaux scientifiques (Chelela et al., 2014 ; Iwalokun et al., 2007 ; Tonjock et Mih, 2011 ; Waithaka et al., 2017) ; plusieurs de ces espèces sont citées dans la pharmacopée traditionnelle africaine (Guissou et al., 2014 ; Oyetayo, 2011 ; Walleyn et Rammeloo, 1994 ; Yongabi, 2019).

5L’essentiel des macromycètes tropicaux d’Afrique reste donc inexploré et constitue de fait un vaste potentiel à partir duquel de nouvelles molécules plus efficaces pourraient être identifiées et exploitées, permettant de résoudre, en partie, certaines des résistances évoquées précédemment. L’étude des propriétés antimicrobiennes des extraits bruts de Pleurotus tuber-regium (Rumph. ex Fr.) Singer, basidiomycète supérieur de la famille des Pleurotaceae, s’inscrit dans cette démarche. Cette espèce constitue un modèle intéressant à plusieurs égards : c’est l’une des rares espèces au monde poussant uniquement sur un certain type de substrat sous forme de sclérote-tubercule naturellement préfabriqué dans le sol. Ce substrat est précisément le sclérote qui se présente sous forme de tubercules d’igname ou de truffe (Tuber aestivum ou Tuber uncinatum). En effet, Pleurotus tuber-regium « préfabrique » lui-même ce sclérote dans le sol avant de pousser dessus. L’étude de sa composition (Ijeh et al., 2009 ; Zoberi, 1979) a révélé la présence de constituants différents de ceux du basidiocarpe (chapeau et stipe) qu’il génère. Des études ethnomycologiques (Oyetayo, 2011 ; Walleyn et Rammeloo, 1994 ; Yongabi, 2019) signalent que l’espèce est utilisée dans certains pays d’Afrique pour traiter de nombreuses pathologies humaines. Certes, de rares études antérieures (Adebayo et al., 2018 ; Metsebing et al., 2020 ; Mossebo et al., 2020) ont été menées sur les propriétés antibactériennes de Pleurotus tuber-regium, mais jamais sur les extraits de son sclérote. En effet, les tests cités précédemment ont été, pour certains, réalisés avec des espèces bactériennes différentes ou avec des extraits obtenus avec d’autres types de solvants que ceux utilisés pour cette étude. Plus spécifiquement et compte tenu de ce qui précède, cette étude a eu pour objectif de déterminer l’existence ou non de propriétés antibactériennes et antifongiques dans les extraits bruts à l’hexane et au chloroforme du basidiocarpe (chapeau avec stipe) de Pleurotus tuber-regium, d’une part, et de son sclérote, d’autre part, par la détermination et la comparaison des concentrations minimales inhibitrices

Matériels et méthodes

Matériels

Matériel fongique

6Le matériel fongique est constitué de fragments de basidiocarpes et de sclérotes de Pleurotus tuber-regium prélevés sur un spécimen d’herbier collecté, séché, identifié et encodé dans l’herbier du laboratoire de mycologie de la faculté des Sciences de l’université de Yaoundé 1. Le carpophore (n° HUY1-DM563A) et le sclérote souterrain (n° HUY1-DM563B), qui est son substrat naturel, ont été récoltés le 10 avril 2017 en petite saison des pluies dans les environs de Yaoundé. Les fragments sélectionnés ont été nettoyés, réduits d’abord en de minuscules morceaux à l’aide d’un couteau ou d’un marteau, puis broyés à sec dans un robot électrique. La poudre obtenue a été ensuite conservée dans des sachets plastiques transparents préalablement étiquetés.

Souches de bactéries

7Onze souches de bactéries fournies par la firme Sigma Aldrich (« South Africa branch ») ont été utilisées dans l’étude, dont cinq Gram+ – Bacillus subtilis (ATCC 19659), Enterococcus faecalis (ATCC 13047), Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Mycobacterium smegmatis (ATCC 2155) – et six Gram- – Enterobacter cloacae (ATCC 13047), Proteus vulgaris (ATCC 6380), Klebsiella oxytoca (ATCC 8724), Klebsiella aerogenes (ATCC 13048), Proteus mirabilis (ATCC 7002), Escherichia coli (ATCC 25922).

Souches de champignons microscopiques

8Trois souches de champignons pathogènes ou toxiques pour l’homme, fournies par la firme Sigma Aldrich, ont été utilisées : Candida albicans, Aspergillus fumigatus et Aspergillus ochraceus.

Méthodes

Extraction des substances naturelles brutes

9L’extraction a été réalisée suivant la méthode décrite par Mossebo et al. (2020) et Oba et al. (2020), en utilisant les mêmes quantités de poudre de carpophore et de son sclérote en égales proportions à deux solvants, l’hexane et le chloroforme.

Préparation de la suspension de bactéries

10Une boucle d’inoculation1 a été utilisée pour recouvrir la surface du bouillon nutritif (nutrient broth) utilisé comme milieu de culture des bactéries. Les inocula ont ensuite été obtenus à partir de cultures bactériennes mises en place sur ce bouillon et incubées à 37 °C pendant 12 à 16 h. L’inoculum de chaque espèce de bactérie a été ajusté à la concentration de 1×10⁵ bactéries/ml selon le standard de Mc Farland (1907).

Préparation de la suspension de champignons pathogènes

11Les spores de champignons pathogènes ont été cultivées sur milieu PDA (Peptone Dextrose Agar) jusqu’à sporulation. Vingt-quatre heures avant l’expérience de mesure d’inhibition, une goutte d’eau distillée a été déposée sur cette culture, puis pipetée et déposée sur un hématimètre (marque Neubauer) permettant le comptage. Les spores ont été ensuite diluées à la concentration de 1×10⁵ spores/ml dans une solution de Ringer afin de bloquer temporairement leur germination. Cette suspension de spores a été préparée 24 h avant les tests et conservée au réfrigérateur.

Tests antibactérien et antifongique : détermination de la concentration minimale inhibitrice

12La concentration minimale inhibitrice (CMI) est la plus petite concentration de l’extrait qui inhibe la croissance du microbe (bactérie ou champignon). La CMI de l’extrait brut du carpophore ou du sclérote a été déterminée en utilisant la méthode de microdilution (Eloff, 1998) sur le milieu de culture « Nutrient Broth » pour les bactéries et sur du RPMI 1640 pour les champignons microscopiques pathogènes ou toxiques.

13Trois réplicats de grilles de test de 96 puits (fig. 1), chacune spécifique des bactéries ou champignon à tester, ont été utilisées de la façon suivante (Maragesi et al. 2013) :

• 100 µl de milieu de culture ont été introduits dans chacun des 96 puits de la grille de test ;
• sur la ligne B, colonnes 2 à 11 de la grille, ajout de 100 µl d’extrait de carpophore ou de sclérote préalablement dilué dans 4 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO, 25 mg/ml) (fig. 1A) ;
• sur les lignes C à G : une série de dilutions a été réalisée successivement par colonne. Ainsi, pour la ligne C, 100 µl de la ligne B ont été introduits. La suspension de la ligne C a été mélangée et 100 µl pipetés et introduits à la ligne D, et ainsi de suite jusqu’à la ligne G. Les 100 µl pipetés dans les puits de la ligne G ont été jetés. La concentration en extrait de chaque ligne est ainsi la moitié de celle de la ligne précédente. Les concentrations obtenues sont respectivement pour les lignes B à G : 12,5 mg/ml (B) ; 6,25 mg/ml (C) ; 3,13 mg/ml (D) ; 1,56 mg/ml (E) ; 0,78 mg/mL (F) ; 0,39 mg/ml (G) et font référence pour les mesures comme proxy de la concentration en extrait actif ;
• sur les lignes A et H (A1 à A12 et H1 à H12) et les colonnes 1 et 12 (1A à 1H et 12A à 12H) : les puits ont servi au contrôle de chaque espèce puisqu’elles ne contiennent que le milieu de culture et le DMSO ;
• 100 µl de suspension de chaque bactérie ou de spores des champignons microscopiques à tester ont ensuite été ajoutés dans les puits des lignes et colonnes ayant reçu l’extrait brut, donnant ainsi un volume total de 200 µl dans chaque puits de la grille (fig. 1A) ;
• la grille a ensuite été incubée à 37 ^oC pendant 24 h pour les bactéries et pendant 3 à 4 jours pour les champignons pathogènes ;
• afin de révéler l’effet bactéricide ou fongique de Pleurotus tuber-regium dans les puits, 10 µl de 2-(4-iodophényl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride (INT) préparés à la concentration de 2 mg/ml de DMSO ont été ajoutés dans tous les puits de la grille (fig. 1B), et le tout a été incubé pendant 1 à 5 h pour les bactéries et un à deux (parfois sept) jours pour les champignons microscopiques (Ishaku et al., 2017 ; Praptiwi et al., 2018 ; Fonkui et al., 2018) ;
• les grilles ont ensuite été retirées de l’incubateur et observées. Les puits contenant encore des bactéries ou des champignons virent au rose et ceux ne contenant que des bactéries ou des champignons inactifs restent bleus ou gardent la couleur de l’extrait brut utilisé (fig. 1C).

Figure 1 – Tests antibactérien et antifongique sur la grille à 96 puits.

Analyse des données

14L’analyse visuelle des grilles a permis de déterminer les CMI. La plus petite concentration de l’extrait brut qui inhibe la croissance des bactéries et des champignons pathogènes, après addition du colorant et après incubation, est celle présente dans le premier puits qui ne devient pas rose (fig. 1C).

Résultats

15Les CMI des extraits bruts du basidiocarpe et du sclérote de Pleurotus tuber-regium sur les bactéries et les champignons pathogènes testés sont présentées respectivement dans les tableaux 1 et 2. Les données montrent que les deux extraits présentent une activité inhibitrice sur les bactéries et les champignons pathogènes. En effet, la CMI des extraits du basidiocarpe sur Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis, Escherichia cloacae, Proteus vulgaris, Klebsiella oxytoca, Klebsiella aerogenes et Proteus mirabilis est de 12,5 mg/ml ; elle est de 6,25 mg/ml pour Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Mycobacterium smegmatis et pour toutes les souches de champignons pathogènes testées, notamment Candida albicans, Aspergillus fumigetus et Aspergillus ochraceus.

16Concernant les extraits du sclérote, la CMI est de 12,5 mg/ml pour Bacillus subtilis et Klebsiella aerogenes et de 6,25 mg/ml sur Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis, Enterobacter cloacae, Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatis, Proteus vulgaris, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis et Escherichia coli. Elle est de 3,13 mg/ml pour les trois espèces de champignons pathogènes.

17Les CMI de l’extrait brut du basidiocarpe et du sclérote sur les bactéries varient entre 6,25 et 12,5 mg/ml. Elle est de 6,25 mg/ml sur tous les champignons pathogènes pour l’extrait brut du basidiocarpe et de 3,13 mg/ml pour l’extrait brut du sclérote.

18En général, l’activité antimicrobienne des extraits bruts de Pleurotus tuber-regium, qu’il s’agisse du basidiocarpe ou de son sclérote, est plus forte sur les champignons pathogènes que sur les bactéries (tabl. 1 et 2, fig. 2 et 3). Les extraits bruts du sclérote montrent une activité antimicrobienne plus forte que ceux du basidiocarpe, autant sur les bactéries (à l’exception de B. subtilis et K. aerogenes) que sur les trois espèces de champignons pathogènes.

Discussion

19Seules quelques rares espèces de macromycètes tropicaux d’Afrique ont déjà fait l’objet de tests antibactériens et antifongiques et de détermination de CMI par le passé (Waithaka et al., 2017 ; Chelela et al., 2014). La grande majorité des macromycètes tropicaux d’Afrique reste encore à investiguer. Les valeurs des CMI déterminées par nos travaux sont proches de celles obtenues par des travaux similaires réalisés avec des extraits bruts de champignons comestibles et/ou toxiques (Waithaka et al., 2017 ; Chelela et al., 2014 ; Subrata et al., 2012 ; Hassan et al., 2011).

20Selon Algiannis et al. (2001), l’efficacité de l’activité antimicrobienne des extraits bruts de macromycètes peut être évaluée par les valeurs des CMI mesurées. Cet auteur affirme en effet que les espèces dont la CMI est inférieure à 0,5 mg/ml sont de puissants inhibiteurs, celles dont la CMI est comprise entre 0,6 et 1,5 mg/ml sont des inhibiteurs modérés, et celles dont la CMI est supérieure à 1,6 mg/ml sont de faibles inhibiteurs. En comparant nos résultats avec ceux de cette étude, nous pouvons affirmer que, en général, les extraits bruts du basidiocarpe et du sclérote de Pleurotus tuber-regium sont de faibles inhibiteurs avec, cependant, une meilleure sensibilité vis-à-vis des champignons pathogènes que des bactéries testées.

21Dans une étude similaire sur les activités antibactériennes et antifongiques de quelques espèces de champignons sauvages, dans laquelle la CMI a servi de valeur de comparaison, Chelela et al. (2014) ont évalué l’activité des extraits bruts de ces champignons en utilisant respectivement la gentamycine et le fluconazole comme témoins positifs pour les activités antibactériennes et antifongiques. Les valeurs de CMI enregistrées par ces auteurs varient de 0,0015 à 0,0061 mg/ml pour la gentamycine, selon les espèces de bactéries testées, et de 0,003 à 0,006 mg/ml pour le fluconazole selon les espèces de champignons. Selon l’échelle de Algiannis et al. (2001), ces valeurs de CMI montrent que ces produits synthétiques antibactériens et antifongiques sont des puissants inhibiteurs comparés aux extraits du carpophore et du sclérote de Pleurotus tuber-regium (tabl. 1 et 2 ; fig. 2 et 3). Toutefois, les valeurs des CMI des extraits des carpophores et sclérotes de Pleurotus tuber-regium pourraient être améliorées grâce à d’autres solvants et en variant les concentrations des extraits.

Figure 2 – Histogramme et courbe comparant les concentrations minimales d’inhibition des extraits bruts du basidiocarpe (Ο) et du sclérote (Δ) de Pleurotus tuber-regium sur onze souches de bactéries pathogènes pour l’homme.

Figure 3 – Histogramme et courbe comparant les concentrations minimales d’inhibition des extraits bruts du basidiocarpe (Ο) et du sclérote (Δ) de Pleurotus tuber-regium sur trois souches de champignons pathogènes pour l’homme.

22Pleurotus tuber-regium est jusqu’à présent utilisé dans la pharmacopée traditionnelle africaine pour traiter d’autres pathologies telles que les maux de tête, la fièvre, les douleurs d’estomac, la constipation, l’asthme, les furoncles, les palpitations cardiaques, l’hypertension artérielle, etc. (Oyetayo, 2011 ; Walleyn et Rammeloo, 1994). Nos résultats démontrent que cette espèce utilisée à dose suffisante présente aussi des propriétés antibactériennes et antifongiques. Badalyan et al (2008) et Adebayo et al. (2018) avaient déjà démontré l’effet antagoniste des extraits des carpophores de Pleurotus tuber-regium sur une autre sélection de champignons pathogènes, mais le sclérote n’avait pas été testé. Mossebo et al. 2020 ont obtenu des valeurs de CMI très proches lors de tests réalisés sur Pleurotus tuber-regium en comparaison avec celles obtenues sur d’autres macromycètes, ce qui conforte les résultats obtenus dans cette étude. Notre étude constitue de ce fait une importante contribution à ce vaste champ de recherche, encore très peu exploré, sur les propriétés médicinales des champignons macroscopiques d’Afrique tropicale.

Conclusion

23Les résultats de cette étude montrent que Pleurotus tuber-regium contient, autant dans son basidiocarpe que dans son sclérote, des substances naturelles aux propriétés antibactériennes et antifongiques. Toutefois, son activité antifongique est plus importante que son activité antibactérienne ; une activité plus élevée est également constatée avec les extraits du sclérote par rapport à ceux du basidiocarpe. Sur la base de ces résultats préliminaires prometteurs, des études ultérieures plus approfondies pourraient être envisagées afin d’extraire et d’identifier avec précision les composants actifs des extraits bruts. La fabrication de tels produits naturels ou pharmaceutiques pourrait aider à soigner plus efficacement certains types d’infections bactériennes et surtout fongiques, comme les mycoses ou mycotoxicoses à Candida albicans, ou encore les aspergilloses à Aspergillus fumigatus ou ochraceus.